Caenorhabditis elegans, un modello inatteso nella sperimentazione animale

di Augusto Minieri, Francesco Agrestri, Simone Assediato, Maria Barra, Alessandro Iorio, Ilaria Pisano, Luigi Romano, Mariaelena Trombone, Guendalina Froechlich, Nicola Zambrano.

Questo articolo è stato elaborato da un gruppo di studenti del I anno del Corso di Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Napoli Federico II, su argomenti trattati nel modulo di attività didattica interattiva (ADI) del Corso di Biologia Molecolare e Cellulare, svoltosi nel II semestre dell’a.a. 2014-2015. L’iniziativa che ha portato all’elaborazione e alla stesura dei contenuti di questo articolo è stata promossa dall’Associazione Culturale DiSciMuS  RFC, nell’ambito delle sue attività di stimolo e supporto per attività pubblicistico-divulgative da parte di giovani studenti. AM, GF e NZ hanno anche contribuito alla revisione dei contenuti e all’elaborazione finale del testo.

 

1. Organismi modello nella ricerca biomedica: un breve excursus

Gli organismi modello sono stati e costituiscono tuttora una risorsa fondamentale per gli studi negli ambiti delle scienze biomediche. Essendo infatti ben noto che molti meccanismi biologici fondamentali sono estremamente simili tra i viventi, grazie alla sperimentazione sugli organismi modello si è riusciti ad appropriarsi di informazioni di rilievo per il progresso scientifico e clinico, acquisendo nuove informazioni sulle malattie umane, sul loro decorso, sulla loro prevenzione e talvolta sulla loro cura. È ben noto infatti che tutte le specie viventi condividono le unità molecolari più semplici alla base della vita, ed i meccanismi che li utilizzano. A partire dal DNA infatti, i nucleotidi che lo costituiscono sono i medesimi per tutte le specie viventi. Anche l’informazione genetica in esso contenuta è codificata con un linguaggio pressoché universale chiamato codice genetico. Più a valle, nel percorso dell’espressione genica troviamo gli amminoacidi,  i building blocks  delle proteine, che rappresentano altre molecole che rendono simili tutti gli organismi viventi. Non solo le unità semplici, ma anche le loro combinazioni, nell’assortimento di sequenze di geni e trascritti di RNA (nel caso degli acidi nucleici) e di sequenze polipeptidiche (nel caso delle proteine) possono mantenere un certo grado di conservazione tra specie diverse. Alla base di questo concetto si fonda la definizione di geni ortologhi, che codificano in specie diverse per prodotti genici (RNA e proteine) con struttura e funzioni sovrapponibili. Questo ha permesso negli anni di caratterizzare in organismi modello la funzione di molti geni diversi e dei loro prodotti all’interno di meccanismi biologici fondamentali (Figura 1).

Esistono numerosi vantaggi derivanti dall’utilizzo degli organismi modello; la loro diffusione nei laboratori di ricerca sperimentale da un lato esso permette di accumulare rapidamente numerosi individui per la sperimentazione, avendo rapidi processi di riproduzione e crescita, dall’altro permette di superare, almeno in parte, problemi di natura etica legati alla sperimentazione. È da sottolineare che non esiste un modello animale migliore di un altro, in quanto il loro utilizzo va contestualizzato al meccanismo biologico che si intende analizzare; quindi, potremmo generalizzare, affermando che un modello animale sia maggiormente adatto, rispetto ad un altro. Nè, tantomeno, si può pretendere di poter dirimere un problema biologico, attraverso l’uso di un singolo organismo modello; le acquisizioni ottenute in un modello semplice dovranno essere esplorate in modelli più complessi per poterne verificare la validità. Tra i modelli utilizzati, quelli che sicuramente hanno lasciato segni indelebili, e consentito progressi continui e significativi nella storia della biologia e delle scienze biomediche sono rappresentati dal batterio Escherichia coli, dal lievito Saccharomyces cerevisiae, dagli invertebrati Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans e, tra i mammiferi, dal topo, Mus musculus. In questo articolo descriveremo brevemente le caratteristiche di alcuni di essi, concentrando però la descrizione del modello del verme nematode C. elegans. E di esso ne esalteremo le validità alla definizione di organismo modello.

Tra i procarioti (organismi unicellulari privi di nucleo e di sistemi membranosi intracellulari), E. coli rappresenta sicuramente un modello di eccellenza ai fini della ricerca biomedica. Si tratta di un batterio gram-negativo, non patogeno, normalmente presente all’interno della flora batterica dell’intestino dei vertebrati, uomo compreso. La sua forma allungata lo fa annoverare tra i bacilli. Vive in un ambiente semplice da ricreare in laboratorio ad una temperatura di 37 °C, sia in presenza che in assenza di ossigeno. I suoi tempi di duplicazione sono molto brevi (~20 minuti) ed inoltre, riproducendosi per scissione, è capace di creare milioni di cellule figlie geneticamente identiche (concetto, questo, alla base del clonaggio). E. coli è stato utilizzato come organismo modello sin dalla metà del ‘900 quando due scienziati, Salvador Luria e Max Delbruck, in seguito al “test di fluttuazione” dimostrarono che questo batterio acquisisce spontaneamente delle mutazioni per poter sviluppare una resistenza ai batteriofagi. Sfruttando la semplicità molecolare di E. coli, nel suo modello sono stati caratterizzati, nei dettagli molecolari, molti fenomeni biologici, come quelli che provvedono alla perpetuazione ed alla stabilità dell’informazione genetica delle cellule, la replicazione del DNA, la ricombinazione omologa, ed il riparo dei danni al DNA. Non da meno, gli studi sull’espressione genica condotti in E. coli, come la trascrizione del DNA in RNA, e la traduzione degli RNA in proteine, hanno segnato tappe fondamentali nella caratterizzazione di questi meccanismi nelle cellule più complesse degli eucarioti. Ed infatti, tutti questi processi nel modello del procariote E. coli si sono dimostrati eccezionalmente simili ai corrispondenti processi degli eucarioti più complessi.

S. cerevisiae è, tra i modelli eucariotici, quello più semplice; si tratta di un microrganismo unicellulare, come E. coli, ma più complesso del batterio, essendo dotato di tutte quelle caratteristiche (es., involucro nucleare, sistemi intracellulari di membrane, citoscheletro) che caratterizzano le cellule eucariotiche, rendendole più specializzate. Si tratta del comune lievito, noto fin dall’antichità, per essere utilizzato nella panificazione e nella fermentazione di vino e birra. Il ciclo cellulare del lievito è stato caratterizzato nel dettaglio, anzi, ha contribuito notevolmente alla caratterizzazione del ciclo cellulare di cellule degli eucarioti pluricellulari. Esso ha una durata di 90 minuti circa, e in S. cerevisiae avviene per gemmazione; questa caratteristica lo differenzia dal lievito S. pombe che, invece, si divide per scissione. Il genoma di S. cerevisiae è stato il primo, tra quelli eucariotici, ad essere stato completamente sequenziato (1996); esso contiene 6.100 geni, distribuiti nelle 12,1 milioni di coppie di basi che costituiscono il suo DNA. Questo è contraddistinto da una notevole ridondanza poiché il 30 % dei geni è presente in due o più copie; caratteristica che lo rende utile per lo studio di fenomeni di dominanza genetica. Inoltre S. cerevisiae è spesso utilizzato in applicazioni biotecnologiche, per produrre proteine ricombinanti eterologhe (non proprie); infatti in quanto specie eucariotica, e diversamente dal modello di E. coli, il lievito è capace di apportare modifiche post-traduzionali alle proteine prodotte, rendendole maggiormente simili a quelle umane rispetto a quelle prodotte in batteri.

L’utilizzo di sistemi modello animali ha determinato un impulso notevole allo sviluppo della genetica attraverso il moscerino della frutta D. melanogaster; agli inizi del ‘900 W. Castle dapprima, e quindi T.H. Morgan, portarono nuova linfa agli esperimenti del monaco Gregorio Mendel, scegliendo Drosophila come organismo modello. Mendel aveva utilizzato per i suoi esperimenti le piante di pisello comune (Pisum sativum). All’epoca si credeva all’ereditarietà dei caratteri per mescolanza, ma già dalla metà dell‘800 i risultati degli esperimenti di Mendel furono in contrasto con tale ipotesi. I brillanti risultati che Mendel ottenne però, non potevano essere supportati da un’adeguata conoscenza della genetica. Ciò nonostante, egli formulò le due leggi, ancora oggi alla base della genetica classica. Quando, agli inizi del ‘900 Morgan decise di ripercorrere i suoi studi, il successo delle sue sperimentazioni fu sancito dalla scelta di questo appropriato modello sperimentale animale. Morgan con i suoi esperimenti su D. melanogaster riuscì non solo ad individuare i caratteri associati ad un certo cromosoma, o a cromosomi diversi, ma anche quelli legati al sesso. A Morgan, e a D. melanogaster, dobbiamo ad esempio le prime intuizioni sull’organizzazione dei cromosomi e dei geni in essi contenuti, grazie alle caratterizzazioni delle distanze fisiche tra i geni, ed il conio dell’unità di misura di tali distanze, il centimorgan. Oggi, il dettaglio molecolare acquisito anche grazie a queste conquiste della conoscenza consente di misurare la successione dei geni lungo i cromosomi in coppie di basi. Ancora oggi D. melanogaster è ampiamente utilizzato come organismo modello, in particolare per gli studi di embriogenesi e più in generale nella biologia dello sviluppo.

Enormi progressi della scienza più moderna sono stati sanciti dall’introduzione di mammiferi nella ricerca. Mus musculus, il topo comune, è il mammifero maggiormente utilizzato tra gli organismi modello in tutto il mondo. Esso possiede un genoma abbastanza affine a quello umano; esso infatti ne ha quasi la stessa estensione e codifica per un numero simile di proteine. Ben il 99% dei geni di Mus musculus trova una corrispondenza nei geni ortologhi della specie umana. Anche in considerazione della complessità dell’organismo, il topo ha dei tempi di riproduzione relativamente brevi (tre settimane di gestazione ed un’età di circa due mesi per raggiungere la maturità sessuale), e genera una prole numerosa. Permette inoltre l’osservazione di condizioni fisio-patologiche sovrapponibili a quelle umane, ed infatti il topo costituisce un sistema maggiormente utilizzato per generare modelli di malattie, umane ed animali. A Clarence Cook Little è riconosciuto il merito di aver compreso, e soprattutto, di aver generato, le prime linee pure di topo per conferire maggiore validità alla sperimentazione con il roditore. Attraverso l’incrocio tra consanguinei egli sviluppò per primo il ceppo DBA, quindi il ceppo C57BL (dal manto nero), che venne successivamente preso come modello per determinare l’intera sequenza del genoma murino, e che a tutt’oggi rappresenta un modello di riferimento per gli studi genetici, comportamentali e per la riproduzione di condizioni legate a malattie umane. Da quel momento gli scienziati, avvalendosi delle metodiche di transgenesi e di knock-out genico ottengono preziosi modelli per lo studio di specifici geni e per l’analisi di malattie umane. Fondamentali, nella relativa facilità con cui oggi possiamo studiare le funzioni in vivo di numerosi geni, e generare modelli animali di malattie umane in questo roditore, sono stati i progressi nell’embriologia e nella capacità di alterare geneticamente il genoma del topo attraverso ricombinazione omologa  (scoperte del Premio Nobel 2007 per la Fisiologia o la Medicina, Mario Capecchi).

2. Il sistema modello che non ti aspetti: Caenorhabditis elegans

C. elegans è un verme, appartenente al phylum dei nematodi, che vive in terreni fangosi in zone temperate. Come è stato introdotto C. elegans tra gli organismi modello? Chi ha intuito che, nonostante le profonde differenze di organizzazione macroscopiche, gli organismi superiori e C. elegans non fossero poi così diversi nei meccanismi molecolari fondamentali della vita,? E soprattutto, chi ha intuito che queste somiglianze potessero rappresentare le basi per scoprire meccanismi biologici di rilievo per la Medicina? Fu Sydney Brenner, il “papà” di C. elegans.

Sydney Brenner nacque a Germiston, in Sudafrica, nel 1927. Nel 1947 si laureò in Medicina presso l’Università di Johannesburg, ma ben presto si trasferì in Inghilterra, dove iniziò a collaborare con scienziati del calibro di Francis Crick. Tra i suoi primi studi nel campo della biologia molecolare ricordiamo l’intuizione che portò Francis Crick a proporre il concetto di adattatore o, come è ormai noto, RNA transfer (tRNA), alla base del flusso unidirezionale dell’informazione genetica. A seguito di questa intuizione, Brenner propose il concetto di RNA messaggero e successivamente, con Francis Crick, Leslie Barnett e Richard J. Watts-Tobin, egli dimostrò il ruolo e la natura delle triplette del codice per la traduzione di proteine. Le sue ricerche su C. elegans iniziarono nel 1965. Brenner ipotizzò che gli studi sul differenziamento cellulare e sullo sviluppo organogenetico potessero essere trattati e meglio gestiti su animali di piccola taglia. La soluzione si rivelò essere il verme nematode C. elegans. Brenner gettò le basi di questo lavoro in una pubblicazione del 1974, in cui dimostrava che le mutazioni di geni specifici nel genoma di C. elegans potevano essere indotte dal composto chimico sulfonato di etil-metano. Queste scoperte rappresentano la pietra miliare di un lavoro condotto per oltre 30 anni da Brenner in collaborazione con Horvitz e Sulston, culminato nel 2002, anno in cui i tre ricercatori furono insigniti del premio Nobel per la Medicina o la Fisiologia. Utilizzando questo modello essi hanno compreso le basi dello sviluppo organogenetico e quelle della apoptosi, o morte cellulare programmata.  I contemporanei progressi nel sequenziamento completo del genoma di C. elegans e degli organismi superiori, uomo compreso, permisero di individuare i geni responsabili di questi processi, e di verificare che essi fossero del tutto analoghi tra i metazoi (animali pluricellulari). A Stoccolma, durante la relazione in occasione della consegna del premio Nobel, Brenner intervenne affermando: “È importante ribadire che siamo tutti accomunati da un processo biologico che ci rende simili. E, finalmente, possediamo gli strumenti per studiare l’uomo; per la prima volta possiamo definire un collegamento tra la biologia e la medicina umana”.

John Sulston, sfruttando il modello di C. elegans e proficue collaborazioni con Brenner e Horvitz, sviluppò tecniche per lo studio di tutte le divisioni cellulari nel verme, a partire dall’ovocita fecondato e fino alle 959 cellule dell’organismo adulto. In una pubblicazione del 1976, egli descrisse la discendenza cellulare per una parte del sistema nervoso in fase di sviluppo, dimostrando che in tutti i nematodi si verifica lo stesso programma di divisione e differenziazione cellulare. Sulla base di questi risultati, Sulston  giunse alla scoperta fondamentale che cellule specifiche nella discendenza cellulare muoiono sempre per apoptosi, a sottolineare il significato assolutamente fisiologico di questi eventi. Egli descrisse le fasi visibili del processo di morte cellulare e dimostrò le prime mutazioni dei geni che partecipano all’apoptosi, compreso il gene nuc-1. Lo studio di questo gene ha portato alla scoperta che la proteina da esso codificata è necessaria per la degradazione del DNA della cellula in apoptosi.

Robert Horvitz, parallelamente al lavoro di Brenner e Sulston sulla genetica e sulla discendenza cellulare di C. elegans, in una serie di esperimenti iniziati negli anni ’70, indagò sulle basi genetiche del programma preposto al controllo della morte cellulare. Con i suoi collaboratori egli individuò numerosi geni, tra cui ced-3 e ced-4, dimostrandone il ruolo nella morte cellulare fisiologica. Horvitz dimostrò, inoltre, che un altro gene, ced-9, esplicava un’azione protettiva nei confronti della morte cellulare interagendo funzionalmente con ced-4 e ced-3, e giungendo altresì all’identificazione dei geni per l’eliminazione della cellula morta. Infatti, l’apoptosi è un meccanismo “pulito” di morte cellulare, innocuo per il tessuto in cui essa avviene. Ciò, a differenza della necrosi, che può comportare danni al tessuto circostante, in quanto la cellula che la subisce rilascia all’esterno numerosi enzimi degradativi. Oggi, grazie alle intuizioni ed alle scoperte di Brenner, Sulston ed Horvitz, siamo in grado di affermare che la maggior parte dei geni coinvolti nel controllo della morte cellulare programmata in C. elegans hanno corrispondenti nell’uomo, e che le proteine codificate da questi geni agiscono lungo una serie di eventi successivi, lungo un vero e proprio percorso, o pathway.

2.1 Caratteristiche anatomo-fisiologiche dell’organismo modello C. elegans

Come per tanti organismi modello, C. elegans è facilmente allevabile in laboratorio. Ha il corpo trasparente, peculiarità che lo rende molto utile per osservazioni al microscopio. Il suo breve ciclo vitale, di 3,5 giorni a 20 °C, permette di ottenerne rapidamente popolazioni numerose; caratteristica, quest’ultima, fondamentale sia per le indagini genetiche che per quelle molecolari.
C. elegans è caratterizzato da due sessi: l’ermafrodita e il maschio. Il primo è capace di auto- fecondazione, mentre il secondo feconda gli ermafroditi, rendendo così possibile l’incrocio tra genotipi diversi. Nonostante alcune differenze, entrambi i sessi hanno una lunghezza intorno ad 1 mm nelle rispettive fasi adulte (Figura 2).

L’estremità cefalica del verme rappresenta la porzione anteriore, occupata essenzialmente dalla faringe; essa è suddivisa in tre porzioni, il corpo, l’istmo e il bulbo terminale, ed è composta da 20 cellule muscolari, 20 nervose e 18 epiteliali. Tali cellule si organizzano in modo da consentire l’ingestione dei batteri attraverso una contrazione muscolare coordinata. I movimenti eseguiti dall’organismo per catturare batteri sono il pumping e la peristalsi istmica. Il primo consiste nella contrazione della maggior parte dei muscoli della faringe (del corpo, della parte anteriore dell’istmo e del bulbo terminale). Ciò permette che il lume della faringe si apra in modo da incamerare liquido e i batteri in esso sospesi. La contrazione è mediata dai recettori dell’acetilcolina attivati a loro volta dai motoneuroni MC. La peristalsi istmica corrisponde ad una contrazione dei muscoli della metà posteriore dell’istmo che porta all’intestino il cibo incamerato.

Una volta ingeriti, i batteri vengono demoliti nel bulbo terminale a livello del grinder e, attraverso la valvola faringo-intestinale, passano all’intestino. Quest’ultimo è costituito da una struttura tubulare di un unico strato di 20 cellule che formano una struttura a 9 anelli.

Lo pseudoceloma separa il canale digerente dall’ipoderma, formato da un solo strato di cellule multinucleate, che hanno il compito di sintetizzare il collagene, tra i maggiori componenti della cuticola, una struttura che forma una sorta di esoscheletro, che riveste il corpo del verme e permette l’attacco dei muscoli per la locomozione. Le cellule muscolari formano le quattro bande che attraversano l’intero corpo del verme, sottoventralmente e sottodorsalmente. Contrazioni coordinate dei muscoli subventrali e subdorsali generano il tipico movimento sinuoso di C. elegans.

Il sistema escretore è formato da 4 cellule: cellula del canale escretorio, cellula del poro escretore, cellula della ghiandola escretoria e cellula escretoria. L’apparato digerente ed escretore sono abbastanza simili in entrambi i sessi, mentre le maggiori differenze tra maschio ed ermafrodita risiedono nel sistema delle gonadi. Le gonadi dell’ermafrodita sono costituite da due bracci (gonade prossimale e gonade distale) uniti all’utero, posto al centro mediante una regione detta spermateca. Uno dei due bracci ha il compito di generare gli oociti i quali, dopo divisione mitotica e meiotica, a livello della spermateca vengono fecondati e dopo un breve periodo di gestazione, che analizzeremo in seguito, sono rilasciati a livello della vulva, un orifizio che si apre a livello della cuticola nella zona medio-ventrale del verme.

Il maschio invece presenta una gonade caratterizzata da un solo braccio che si apre all’esterno attraverso la cloaca (l’ano). La cloaca è costituita dal proctodeum, una particolare disposizione dell’epitelio; quest’ultima infatti comprende dei sensori che individuano l’ermafrodita e fanno sì che la vulva di quest’ultima non si chiuda durante la fecondazione. (… segue …)

Leggi l’articolo completo: Augusto Minieri, Francesco Agrestri, Simone Assediato, Maria Barra, Alessandro Iorio, Ilaria Pisano, Luigi Romano, Mariaelena Trombone, Guendalina Froechlich, Nicola Zambrano, Caenorhabditis elegans, un modello inatteso nella sperimentazione animale, in Scienze e Ricerche n. 24, 1° marzo 2016, pp. 21-27