Teratologia: la tossicologia dello sviluppo embrionale

di Erminio Giavini, Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano.

(tratto da: Erminio Giavini, Teratologia: la tossicologia dello sviluppo embrionale, in Scienze e Ricerche, n. 5, marzo 2015, pp. 19-24)

Introduzione storica

La teratologia è la disciplina che si occupa delle malformazioni congenite (m.c.). Il termine deriva dal greco Ϯήρασ dal significato originario di stella, astro celeste, degenerato in cosa meravigliosa, segno premonitore e, infine, nel significato di mostro (latino monstrum = prodigio, segno degli dei).La frequenza delle malformazioni congenite nei paesi occidentali è dell’ordine del 3% dei nati vivi. Ciò significa che in un paese come l’Italia, in cui nascono attualmente circa 500.000 bambini/anno, quasi 15.000 di loro possono essere portatori di m.c.. La gravità delle malformazioni è variabile: da vere e proprie mostruosità, spesso incompatibili con la vita, a gravi alterazioni morfologico-funzionali gravemente disabilitanti, a lesioni d’organo risolvibili con interventi chirurgici riabilitativi (alterazioni della settazione cardiaca, palatoschisi). In alcuni casi le malformazioni non sono di tipo morfologico ma funzionale. Rientrano tra queste le lesioni cerebrali di vario grado con deficit intellettuale e talvolta anche con impedimento motorio. Nel complesso è chiaro che le m.c. rappresentano un problema di enorme impatto sociale non solo per le gravi conseguenze emotive e umanitarie che si verificano nelle famiglie colpite da queste pesanti patologie, ma anche per il non irrilevante impatto economico che hanno nel bilancio del servizio sanitario nazionale dal momento che molti individui affetti da m.c. richiedono cure e supporti medici e paramedici per tutta la vita. Malformazioni congenite si sono verificate sempre nella storia dell’uomo, come documentato dalla mitologia greca e dalle osservazioni di Aristotele su queste alterazioni dello sviluppo. Molti scienziati dei secoli passati si sono occupati dell’argomento riportando casi di malformazioni reali e anche di pura fantasia (si veda, ad esempio, il mostro di Cracovia che si narra fosse nato nella città polacca nel 1543 con teste di cane a livello delle articolazioni del ginocchio e del gomito e teste di scimmia alle ascelle). Solo nel 1832 venne pubblicato il primo vero trattato di Teratologia ad opera dell’anatomico francese Isidore Geoffroy de Saint Hilaire, una mastodontica opera in tre volumi in cui l’autore descrive minuziosamente e classifica tutti i tipi di malformazioni (vere) fino ad allora conosciute (in pratica tutte le malformazioni note anche ai giorni nostri). La grande opera del Saint Hilaire è a tutt’oggi valida per la nomenclatura scientifica delle principali m.c.. Ma l’interrogativo che generazioni di scienziati si era posto era quello concernente le cause delle malformazioni. Tra il Medio Evo e la fine del XIX secolo le cause più accettate erano anche le più fantasiose: accoppiamento con animali o, ancor peggio per le conseguenze, con il demonio; immaginazione, influssi degli astri ed altro (Giavini, 2004). Solo alla fine del XIX secolo, anche sulla scorta delle nuove scoperte e tecniche nel campo dell’embriologia, Camille Dareste affronta il problema delle m.c. da un punto di vista sperimentale. Il modello sperimentale di cui disponeva era l’embrione di pollo in ovo, qualcosa su cui non era semplice agire per ottenere alterazioni dello sviluppo. Ciononostante Dareste riuscì ad ottenere una vasta gamma di m.c., molte delle quali paragonabili a quelle osservate nell’uomo, attraverso semplici ma efficaci interventi come descrive dettagliatamente nel suo “Reserches sur la production artificielle des monstruosités” pubblicato nel 1871. Attraverso variazioni della temperatura d’incubazione, scuotimento delle uova, invecchiamento delle uova prima di incubarle fu in grado di ottenere una vastissima tipologia di malformazioni dimostrando per la prima volta che fattori esogeni di tipo fisico potevano alterare gravemente lo sviluppo embrionale. Parecchi anni più tardi F. Hale (1933) notò che maialini nati da madri mantenute con diete carenti in vitamina A erano privi di occhi. Si apriva in questo modo la ricerca teratologica impegnata a verificare se agenti chimici potessero interferire con lo sviluppo normale dell’embrione di mammifero. In una prima fase, sulla base dei risultati di Hale, si testarono su topi e ratti diete carenti di diversi tipi di vitamine. Warkany e Nelson (1942) dimostrarono l’attività teratogena di diete carenti in vitamina B2 nel ratto e Thiersch nel 1950 dimostrava che la somministrazione a ratte gravide di aminopterina, un potente antagonista dell’acido folico, determinava la morte di tutti gli embrioni. Sulla base di questo risultato pensò di utilizzare l’aminopterina come abortivo nelle donne. In un primo esperimento clinico dieci delle dodici donne cui fu amministrato il farmaco abortirono, ma due di loro, dopo parto cesareo, misero alla luce feti affetti da gravissime malformazioni. Dunque sostanze chimiche cui era esposta la madre nei primi mesi di gravidanza erano in grado di indurre malformazioni. Negli anni ’50 del secolo scorso la sperimentazione di numerose sostanze chimiche su animali da laboratorio aveva reso evidente che la teratogenesi chimica era un dato di fatto. Eppure, nonostante il grande numero di prove, questa evidenza rimase confinata nell’ambito accademico, quasi che quegli esperimenti fossero delle interessanti ma poco utili curiosità scientifiche prodotte da valenti ricercatori dotati di uno scarso senso della realtà. La maggior parte degli ostetrici e ginecologi dell’epoca non prese minimamente in considerazione questi dati. Il concetto dell’intangibilità dell’embrione umano da parte di agenti esogeni di qualsiasi tipo, grazie alla protezione della placenta, era dogma. Anche i ministeri della sanità di diversi paesi non consideravano importante alcun tipo di test su farmaci o sostanze chimiche per verificarne la sicurezza in gravidanza. La stessa Food and Drug Administration (FDA), la potente agenzia regolativa degli USA, in un documento del 1955 richiedeva alle industrie “appropriate toxicity tests. Recommended procedures fell into reasonably well definied categories, such as pharmacodynamics, acute toxicity, subacute toxicity, chronic toxicity. Reproduction studies are really part of chronic toxicity experiments and should yield information as to whether the substance in question will affect fertility, lactation, size of litter, and mortality of the young”. Nessun riferimento a malformazioni. Il problema principale era la fertilità e, eventualmente, la mortalità embrionale. La cosa più rilevante era che questo tipo di test era richiesto solo per gli additivi alimentari, non per i farmaci o per altre sostanze chimiche. La preoccupazione della FDA era che gli additivi alimentari, introdotti con il cibo presumibilmente per lunghi periodi di tempo, potessero indurre effetti indesiderati a livello delle gonadi. Eppure altre importanti scoperte avrebbero dovuto aprire gli occhi a chi di dovere circa la permeabilità della placenta umana. Nel 1941 un giovane oftalmologo australiano, Norman McAlistair Gregg, aveva verificato una insolitamente elevata incidenza di bambini affetti da cataratta, spesso associata ad altre malformazioni, più frequentemente cardiache. Gregg fu in grado di scoprire che questi bimbi erano nati da donne che avevano contratto, durante la gravidanza, la rosolia di cui si era avuta un’epidemia alcuni mesi prima. L’associazione tra queste m.c. e la rosolia fu presto confermata e accettata. Dunque un virus poteva essere causa di m.c. nell’uomo. Inoltre, fin dal 1939, si sapeva che la toxoplasmosi in gravidanza poteva essere causa di malformazioni cerebrali.

Nel 1957 l’industria chimico-farmaceutica tedesca Grunenthal immetteva sul mercato un sedativo di mediocre attività farmacologica che risultò essere molto attivo come antiemetico in gravidanza. Si chiamava Talidomide e fu un successo internazionale. Il 16 settembre 1961 H. R. Wiedemann riportava su Med. Welt che un’inusuale malformazione agli arti si era riscontrata nei neonati di donne che avevano utilizzato questo farmaco in gravidanza. Il 16 dicembre 1961 la rivista Lancet pubblicava una lettera di 15 righe inviata dal pediatra australiano W. G. McBride che scriveva: ”negli ultimi mesi ho notato che l’incidenza di anomalie multiple in bambini nati da donne che hanno utilizzato talidomide in gravidanza è molto elevata. Si tratta prevalentemente di malformazioni delle ossa. Qualcuno dei vostri lettori ha visto simili malformazioni in figli di donne che hanno fatto uso di questo farmaco in gravidanza?” Il 6 gennaio 1962 W. Lenz confermava in una lettera a Lancet di aver visto 52 bimbi affetti da malformazioni agli arti nati da donne che avevano utilizzato Contergan (Talidomide) in gravidanza e che, dopo aver discusso della possibile correlazione Contergan – malformazioni in una conferenza, aveva ricevuto lettere che riportavano altri 115 casi. Si trattava prevalentemente di malformazioni a livello degli arti che andavano, nei casi più gravi, dalla completa assenza degli arti (amelia), all’assenza delle porzioni intermedie con la mano articolata direttamente alla spalla (focomelia), fino a più modeste malformazioni delle dita. L’associazione talidomide-malformazioni degli arti era chiara, tanto più che dopo le pubblicazioni di Wiedeman, McBride e Lenz, molte altre segnalazioni arrivarono da quasi tutto il mondo. La Grunenthal ritirò il farmaco dal commercio. Si calcola, tuttavia, che nel breve periodo della sua commercializzazione oltre un milione di donne gravide nel mondo ne abbiano fatto uso e che più di 10.000 bambini siano nati con gravi malformazioni non solo agli arti ma anche al sistema cardiovascolare e all’orecchio. Fu una tragedia enorme che aprì gli occhi a tutti coloro che non avevano voluto credere ai risultati sperimentali: alcune sostanze chimiche possono danneggiare seriamente l’embrione indipendentemente dalla loro tossicità sugli organismi adulti. Il Talidomide era un farmaco praticamente atossico, privo di effetti collaterali e privo (almeno quando fu commercializzato) anche di una provata attività farmacologica.

Da quel momento fu tutto un fiorire di studi sperimentali mirati a verificare l’attività teratogena del Talidomide su diversi modelli animali. Lo si somministrò a topi, ratti, criceti, conigli, gatti, cani, diverse specie di scimmie e persino a embrioni di pollo. Ma con risultati deludenti. Malformazioni come quelle osservate nell’uomo furono indotte solo in conigli (usando dosi molto elevate) e in alcune specie di scimmie. Ma anche e soprattutto le agenzie regolative di molti paesi erano in grande fermento per trovare un modo per prevenire quella che non era più considerata una cosa impossibile: l’induzione di m.c. nell’uomo da parte di sostanze chimiche. Si tennero convegni, congressi, riunioni di esperti che portarono nel 1966 la FDA ad emanare le nuove linee guida per gli studi sulla riproduzione e per la valutazione della sicurezza per l’embrione di farmaci per uso umano. Per la prima volta veniva stabilito per legge che prima dell’immissione in commercio di un farmaco questo doveva essere testato per i suoi effetti sulla fertilità ma anche sullo sviluppo embriofetale attraverso due studi ad hoc condotti su due specie animali diverse di cui una doveva essere un roditore (consigliati ratto o topo) ed una un non roditore (consigliato il coniglio). Ben presto molti altri paesi adottarono le linee guida proposte dalla FDA.

Cause di malformazioni

Gli anni che seguirono il tragico evento del Talidomide non si limitarono a produrre un numero enorme di ricerche sperimentali sugli effetti di sostanze chimiche somministrate durante la gravidanza. Videro anche una svolta nella ricerca epidemiologica sul rapporto tra m.c. e loro possibili cause, ricerche che continuano incessantemente anche ai giorni nostri. Ciò ha permesso di individuare le principali cause di m.c. nell’uomo. Secondo Nelson e Holmes (1989) circa il 28% delle malformazioni è di origine genetica (aberrazioni cromosomiche o alterazioni monogeniche); il 2% è dovuto ad infezioni materne in gravidanza (rosolia, toxoplasmosi, citomegalovirus); l’1,5% è dovuto a malattie dismetaboliche materne (diabete, fenilchetonuria); meno dell’1% a fattori fisici (raggi X, ipertermia), circa il 2% ad esposizione a sostanze chimiche, inclusi i farmaci. Il problema è che circa il 65% delle m.c. nell’uomo è ancora da eziologia sconosciuta, non si conosce, insomma, quale sia la loro causa. Per quanto riguarda le sostanze chimiche, quelle accertate per essere causa di malformazioni nell’uomo sono elencate nella tabella seguente:

 

 

Agente Funzione Effetti
Aminopterina, metotrexate Antitumorali, antagonisti folati Malformazioni multiple
Androgeni Ormoni Mascolinizzazione genitali esterni
Acido valproico Anticonvulsivo Spina bifida, malformazioni facciali
Carbamazepina Anticonvulsivo Spina bifida, malformazioni multiple
Cocaina Sostanza ricreativa Lesioni cerebrali e renali
Cumarina, warfarina Anticoagulante Ipoplasia nasale, malformazioni cerebrali, aborto
Dietilstibestrolo Estrogeno sintetico Alterazioni genitali esterni, neoplasie vaginali
Etanolo Solvente, sostanza ricreativa Malformazioni facciali, cerebrali
Fenitoina Anticonvulsivo Malformazioni facciali e multiple
Mercurio Scarto industriale Paralisi cerebrale, ritardo mentale
Piombo Scarto industriale Ritardo mentale
PCBs (bifenili policlorurati) Contaminanti ambientali Ritardo mentale, pigmentazione cute
Retinoidi Antiacne Sistema nervoso, orecchio, cuore, scheletro
Talidomide Antiemetico, antitumorale Arti, cuore, orecchio, autismo(?)
Tetracicline Antibiotici Pigmentazione denti

 

Ma non siamo per niente certi che sia del tutto esauriente. Il problema, dal punto di vista epidemiologico, è che, per ottenere un risultato statisticamente significativo, è necessario che vi sia un incremento importante dell’incidenza di una o più malformazioni in relazione alla causa considerata, fenomeno che raramente si verifica (soprattutto se si studiano popolazioni poco numerose) a meno che si abbia a che fare con agenti teratogeni molto potenti. Il timore è che, più frequentemente, gli agenti teratogeni agiscano in maniera subdola provocando un basso numero di malformazioni che sfuggono alle ricerche epidemiologiche anche più sofisticate. D’altra parte il numero di sostanze chimiche che si sono dimostrate in grado di produrre m.c. in una o più specie animali da laboratorio è parecchio più alto.

Principi generali di teratogenesi chimica

Le numerose ricerche condotte sia prima che dopo l’evento Talidomide su animali da laboratorio hanno permesso di individuare alcuni principi generali che governano la teratogenesi indotta da sostanze chimiche, formulati per la prima volta da Wilson nel 1973, ma ancora del tutto validi.

1)     Come in altri campi della tossicologia anche nella teratogenesi vale il principio della relazione dose – effetto. La frequenza e la gravità delle malformazioni incrementano con l’incrementare della dose utilizzata, partendo da una dose priva di effetti per arrivare ad una dose che provoca il 100% di effetto. Spesso le dosi alte provocano la morte dell’embrione, probabilmente perché inducono malformazioni talmente gravi da essere incompatibili con la vita intrauterina. Questo principio è molto importante dal punto di vista tossicologico perché sottintende che la teratogenesi è un fenomeno a soglia e non un fenomeno stocastico; quindi, in esperimenti ben condotti, è possibile individuare sempre, per una determinata sostanza, una dose al di sotto della quale non è possibile indurre malformazioni.

2)     La teratogenesi chimica è un fenomeno tipicamente specie-specifico. Non tutte le specie sono egualmente sensibili all’effetto teratogeno di un determinato agente. Gli esempi sono numerosi: il Talidomide provoca malformazioni nell’uomo, nel coniglio (a dosi 100 volte superiori alla dose terapeutica) e in alcune specie di scimmie, ma non nel topo o nel ratto; l’acido valproico provoca spina bifida nell’uomo ma non nel ratto in cui induce malformazioni allo scheletro assile mai osservate nell’uomo; all’opposto l’acido acetilsalicilico (aspirina) provoca malformazioni scheletriche nei roditori ma non nell’uomo. Le differenze nella risposta talvolta non si limitano alla specie, ma si riscontrano anche a livello di sottospecie o ceppi: il cortisone è in grado di indurre palatoschisi nei topi di ceppo C57Bl ma non nei topi di ceppo A, a parità di dose e giorno di trattamento.

Le ragioni di queste differenti risposte non sono del tutto chiare. Si ritiene che siano multifattoriali e legate al genotipo materno e dell’embrione, a differenze nel metabolismo dello xenobiotico e a differenze nella tossicocinetica in specie o ceppi diversi. Comunque sia, questo principio pone dei seri limiti nell’interpretazione dei risultati sperimentali ai fini della prevenzione della m.c. da agenti chimici. E’ del tutto evidente che il principio di precauzione farà si che una sostanza che risulti teratogena in una specie animale non venga commercializzata o, se assolutamente necessaria, venga commercializzata adottando opportune misure di sicurezza, diverse a seconda che si tratti di un farmaco o di una sostanza presente nell’ambiente (pesticidi, sostanze chimiche nell’ambiente di lavoro). Nel primo caso è necessario segnalare che il farmaco non deve essere somministrato in donne in età fertile. Nel secondo caso è possibile utilizzare i “ fattori di sicurezza” (FS). Il FS è un valore del tutto empirico che si utilizza per individuare una dose che, ragionevolmente, non dovrebbe costituire un rischio per gli individui esposti: ADI = Admissible Daily Intake. Il fattore di sicurezza si applica alla dose priva di effetti ottenuta negli esperimenti sugli animali. As esempio, se la sostanza X ha una dose priva di effetti di 10mg/kg, applicando un FS di 1000 si ottiene un ADI di 10/1000 = 0,01mg/kg/giorno. Si accetta, insomma, che una dose mille volte inferiore a quella che non produce effetti nell’animale da esperimento possa essere sicura per l’esposizione umana.

3)     Esiste un periodo sensibile per l’induzione di specifiche malformazioni. Prima di tutto è importante sottolineare che gli agenti teratogeni agiscono solo in un determinato periodo della gravidanza, il cosiddetto periodo morfogenetico/organogenetico, durante il quale si individua la struttura generale del corpo dell’embrione e si abbozzano i diversi organi e apparati. Questo periodo ha inizio al momento dell’impianto in utero e dura un periodo di tempo variabile a seconda delle specie. Circa 10 giorni nei roditori, circa due mesi nell’uomo. Nell’ambito del periodo di suscettibilità, inoltre, si ottengono malformazioni diverse a seconda del momento in cui l’embrione è esposto all’agente teratogeno. Le malformazioni a livello dell’arto superiore nei bambini esposti in utero a Talidomide sono state prodotte quando il farmaco è stato somministrato nell’arco di tempo compreso tra il 20° ed il 30° giorno di età embrionale. Prima o dopo questo periodo la malformazione all’arto non è inducibile. Ciò spiegherebbe, in parte, la relativamente bassa frequenza di bambini malformati (circa 10.000) a fronte del gran numero di donne che hanno utilizzato il farmaco in gravidanza: solo quelle che l’hanno utilizzato in quell’arco temporale hanno avuto figli con malformazioni.

4)     Esiste un quarto principio, relativo agli esiti dell’esposizione in utero ad agenti chimici che non sono soltanto malformazioni congenite, ma anche morte dell’embrione, ritardo di sviluppo e deficit funzionale di organi e sistemi( sistema nervoso, immunitario, endocrino, riproduttivo ecc.). Per questa ragione la vecchia terminologia di teratogenesi è stata sostituita con la più moderna e omnicomprensiva “tossicità dello sviluppo”. Con questa nuova visione del problema dell’esposizione in utero l’attenzione non è più focalizzata solo sul periodo organogenetico ma su tutta la gravidanza perché se il periodo organogenetico è quello più a rischio per le alterazioni morfologiche, tutto l’arco della gravidanza è a rischio per alterazioni di tipo funzionale, molto gravi e invalidanti anche se non morfologicamente visibili. Per questa ragione il termine agente teratogeno viene attribuito alle sole sostanze chimiche in grado di indurre m.c.. Per le sostanze che provocano altre patologie embriofetali si preferiscono i termini “agente embriotossico o fetotossico”

Meccanismi di teratogenesi

Nonostante lunghi anni di ricerche, un punto ancora oscuro nella produzione di m.c. è proprio relativo ai meccanismi attraverso i quali gli agenti teratogeni inducono i loro effetti sull’embrione. In questi ultimi anni alcuni passi avanti sono stati fatti per chiarire questo aspetto, ma ancora molto rimane da fare. Le ragioni dell’insuccesso nella completa comprensione dei meccanismi di teratogenesi da agenti chimici sono almeno due: 1) prima di tutto la complessità dei meccanismi molecolari che controllano lo sviluppo embrionale. Durante gli ultimi anni sono stati fatti enormi progressi nella comprensione delle interazioni molecolari che controllano i diversi aspetti dello sviluppo (proliferazione cellulare, migrazione cellulare, differenziamento, apoptosi ecc.), ma ancora esistono molti punti oscuri che devono essere chiariti; 2) la seconda ragione è, in qualche modo, conseguenza della prima. E’ verosimile che gli agenti teratogeni agiscano interferendo con più meccanismi che controllano lo sviluppo embrionale. Sulla base delle attuali conoscenze il controllo dello sviluppo embrionale può essere, semplicisticamente, visto come un’espressione differenziale di specifici geni, in specifici siti ed in specifici momenti dello sviluppo. Questi geni codificano per fattori di trascrizione che attivano o reprimono l’espressione di altri geni. Il preciso coordinamento dei processi di sviluppo richiede interazioni tra cellule e tessuti embrionali attraverso segnali chimici (induzione embrionale) che controllano l’attività di specifici geni. L’espressione genica, inoltre, non è regolata solo da fattori di trascrizione ma anche da altre molecole, chiamate morfogeni, capaci di diffondere lungo le strutture embrionali e di modulare l’espressione genica interagendo con specifici recettori nucleari. L’attività di questi morfogeni è strettamente correlata alla loro concentrazione tissutale regolata da sistemi enzimatici intraembrionali che controllano la loro precisa concentrazione in specifici organi. Uno dei morfogeni più conosciuti è l’acido retinoico.

Alterazioni della concentrazione di acido retinoico

L’acido retinoico (AR), metabolita della vitamina A, è il più noto morfogeno in embrioni animali. Una stretta correlazione tra alterate concentrazioni embrionali di AR e malformazioni cardiache, facciali, del sistema nervoso, delle vertebre e degli arti è stata ampiamente documentata. La sintesi embrionale di AR è basata sulla ossidazione del retinolo attraverso alcool e aldeide deidrogenasi. Il suo catabolismo è controllato da enzimi appartenenti alla famiglia Cyp26 (Cyp26A1, B1, C1). Uno sbilanciamento tra sintesi e degradazione di AR può portare ad un eccesso o ad una carenza del morfogeno con effetti, in entrambi i casi, deleteri per lo sviluppo. Tra le sostanze che si sono dimostrate in grado di interferire con la sintesi di AR vi è l’etanolo, attraverso un’inibizione competitiva degli enzimi deputati alla sua sintesi. D’altra parte, sostanze che siano in grado di interferire con gli enzimi che degradano l’AR possono determinare un aumento, anche transitorio, della sua concentrazione. Tra queste sono stati individuati alcuni fungicidi triazolici in grado di indurre malformazioni facciali e dello scheletro assile in animali da laboratorio.

Iperacetilazione istonica

Il grado di acetilazione degli istoni gioca un ruolo fondamentale nel modulare la struttura della cromatina e la trascrizione genica. L’acetilazione degli istoni, a carico delle acetiltransferasi, favorisce la trascrizione, la loro deacitalazione, operata dalle deacetilasi, la inibisce. Sostanze in grado di inibire le deacetilasi (HDACi, Histone Deacetylase inhibitors) producono una iperacetilazione istonica con conseguente alterata trascrizione genica. In questi ultimi anni sono state individuate numerose sostanze con questa attività e sono state studiate con interesse come possibili antitumorali. Molte di esse, però, possiedono anche una notevole attività teratogena negli animali da esperimento. Lo stesso acido valproico, farmaco antiepilettico d’elezione, si è dimostrato essere un potente HDACi tanto da essere considerato un possibile farmaco antineoplastico. Nei roditori induce malformazioni specifiche a livello dello scheletro assile ed iperacetilazione embrionale a carico dei somiti, gli organi embrionali precursori delle vertebre.

Stress ossidativo

Numerosi xenobiotici possono essere bioattivati enzimaticamente a elettrofili reattivi o a radicali liberi che possono produrre ROS (Reactive Oxigen Species). Questi, se non detossificati da sostanze o da enzimi antiossidativi, possono danneggiare macromolecole importanti quali proteine, RNA e DNA. In generale le cellule sono dotate di un buon macchinario per difendersi dai ROS, che vengono continuamente prodotti fisiologicamente, costituito da enzimi quali le superossidodismutasi e le catalasi e da molecole antiossidanti come il glutatione e le vitamine C ed E. Sfortunatamente l’attività antiossidante delle cellule embrionali è solo pari al 5% di quella delle cellule di organismi adulti sicché l’embrione può essere facilmente oggetto dell’effetto tossico provocato dai ROS. La difenilidantoina incrementa i livelli di ossidazione del glutatione e del DNA embrionali mentre alte concentrazioni di catalasi ne inibiscono l’attività teratogena. La somministrazione di antiossidanti quali la vitamina C o di catalasi riduce anche gli effetti teratogeni indotti da acido valproico in animali da laboratorio. Lo stesso etanolo può indurre stress ossidativo sia direttamente, attraverso la formazione di radicali liberi, che indirettamente riducendo la capacità antiossidante delle cellule (ad esempio riducendo i livelli di glutatione). Esperimenti sia in vitro sia in vivo hanno dimostrato che alte concentrazioni di antiossidanti riducono significativamente la tossicità cellulare indotta da etanolo.

Alterata sintesi di colesterolo

La sintesi intracellulare del colesterolo inizia dall’acetato e prosegue in una lunga serie di passaggi controllati da specifici enzimi. Il knockout di alcuni di questi enzimi nel topo provoca la morte dell’embrione, dimostrando il ruolo fondamentale di questa molecola nello sviluppo embrionale. Nell’uomo esiste una sindrome nota come Smith-Lemly-Optiz syndrome (SLOS) caratterizzata ad malformazioni facciali, palatoschisi, microcefalia, sindattilia e, nelle forme più gravi, ciclopia. Questa sindrome è dovuta ad una mutazione del gene DHCR7 che codifica per la 7-deidrocolesterolreduttasi, un enzima chiave per la sintesi del colesterolo. Topi ko per Dhcr7 presentano palatoschisi e dismorfie facciali. La somministrazione di AY9944, un inibitore sintetico della 7-deidrocolesterolreduttasi, in ratte gravide provoca una riduzione drastica dei livelli di colesterolo plasmatico e malformazioni facciali nei feti compatibili con la ciclopia. La somministrazione di colesterolo è in grado di prevenire le malformazioni indotte da questo inibitore. L’Antley-Bixler syndrome (ABS) è caratterizzata nell’uomo da brachicefalia, ipoplasia facciale, malformazioni cardiache e renali, curvatura anomala delle ossa lunghe. E’ associata ad alterazione del metabolismo degli steroli legata al malfunzionamento dell’enzima Cyp51, un altro enzima sulla via della sintesi del colesterolo. Embrioni di topo ko per il gene che codifica per questo enzima muoiono in utero al 15° giorno di gestazione, ma se vengono esaminati morfologicamente si può osservare che presentano gravi malformazioni cardiache (probabilmente responsabili della morte), ipoplasia facciale, malformazioni agli arti. L’attività dei fungicidi azolici (triazoli e imidazoli) si basa proprio sull’inibizione selettiva di Cyp51 al fine di alterare la sintesi della parete cellulare fungina. Il Fluconazolo ed altri fungicidi azolici impiegati in terapia umana ed in agricoltura si sono dimostrati teratogeni nei roditori provocando malformazioni facciali ed allo scheletro assile. Sono stati, inoltre, riportati alcuni case reports di bambini esposti in utero ad alte dosi di Fluconazolo che presentavano alla nascita malformazioni simili a quelle della ABS.

Alterata espressione genica

Come esposto prima, lo sviluppo embrionale è coordinato da uno stretto controllo genico, quindi alterazioni dell’espressione genica possono provocare alterazioni dello sviluppo. Negli ultimi anni molte ricerche sono state fatte al fine di individuare quali geni vengono modificati nella loro espressione a causa di esposizione dell’embrione a xenobiotici. Mediante la tecnica del microarray si è potuto costatare come uno xenobiotico sia in grado di provocare un grande turbamento nella genomica e proteomica embrionale sia per un effetto diretto dello xenobiotico sul DNA (raramente) sia attraverso altri meccanismi (ROS, iperacetilazione ecc.). In genere l’esposizione ad un singolo xenobiotico modifica l’espressione di decine di geni per molti dei quali non è neppure nota la funzione, per altri la funzione sembra non essere congrua con l’effetto teratogeno indotto, ma talvolta si individuano geni la cui alterata espressione può spiegare l’effetto teratogeno osservato. In realtà, nonostante i numerosi studi condotti, non è ancora stato possibile individuare con sicurezza quali geni siano responsabili degli effetti teratogeni indotti da un particolare agente.

Conclusioni

La teratologia sperimentale, o tossicologia dello sviluppo che dir si voglia, costituisce a tutt’oggi il mezzo più valido per l’individuazione di sostanze chimiche con potenziale teratogeno e, quindi, per prevenire tali effetti sull’uomo. Non è da sottovalutare che, dopo la tragedia del Talidomide, altri episodi del genere non si sono più verificati. Le sostanze teratogene per l’uomo sono sostanze la cui potenzialità di indurre malformazioni era nota, ma che sono state comunque permesse in base al rapporto rischio/beneficio. Molti farmaci teratogeni sul mercato non sono sostituibili (vedi antiepilettici, antitumorali, anticoagulanti). Viceversa, l’etanolo, che costituisce il più importante agente embriotossico per la specie umana, responsabile della maggior parte degli eventi tossici sull’embrione e sul feto, è una sostanza a prevalente uso ricreativo con rilevanti effetti tossici non solo sul prodotto del concepimento, ma anche sull’adulto con noti effetti neurotossici, epatotossici e cancerogeni: ciononostante è di libera vendita. L’intensa attività di ricerca nel settore condotta sia dall’industria chimico- farmaceutica che dall’accademia ha, dunque, validamente contribuito alla prevenzione delle m.c. nell’uomo, anche a scapito di qualche prodotto non immesso sul mercato a scopo precauzionale. Ma è estremamente importante non abbassare la guardia. Al contrario, sarebbe opportuno incentivare le ricerche di base sulla teratologia sperimentale allo scopo di individuare dei marcatori biologici di teratogenicità che, se utilizzati in test alternativi in vitro, permetterebbero una notevole riduzione dei costi della sperimentazione teratologica in vivo.

 

 

Bibliografia essenziale

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