Diapausa embrionale e possibili ripercussioni sulla riproduzione umana

di Erminio Giavini, Università degli Studi di Milano

La diapausa embrionale (DE) consiste in un arresto reversibile dello sviluppo dell’embrione. Si tratta di un fenomeno conosciuto da molto tempo e diffuso largamente nel regno animale sia tra gli invertebrati che nei vertebrati non mammiferi ed anche nei mammiferi ove è stato descritto in oltre 130 specie (Fenelon et al., 2012; Renfree e Fenelon, 2017, Tab. 1). E’ particolarmente diffuso nei mustelidi (lontre, martore, ermellini, furetti, tassi ecc.), in molte specie di otarie e foche, negli orsi, nei marsupiali, in topi e ratti ed anche nel capriolo. Nei mammiferi la DE consiste nell’arresto dello sviluppo allo stadio di blastocisti, quando, cioè, l’embrione è arrivato in utero ma ancora non si è impiantato nella mucosa uterina. Gli scienziati sono tutti d’accordo sul significato strategico della DE: un meccanismo che disaccoppia il momento della fecondazione da quello della nascita, assicurando che lo sviluppo postnatale possa avvenire nelle migliori condizioni ambientali per la sopravvivenza della prole.

Si distinguono due diversi tipi di DE: obbligata o facoltativa. La prima caratterizza ogni gestazione di una data specie, la seconda si manifesta solo in particolari condizioni di stress materno, per esempio se la madre sta allattando o se si presentano condizioni ambientali particolarmente sfavorevoli (mancanza di cibo, temperature rigide). Il modello più studiato di diapausa facoltativa è quello che si riscontra in topi e ratti durante l’allattamento. In queste specie la femmina entra in calore pochi giorni dopo il parto e può subito accoppiarsi, ma gli embrioni, giunti in utero alla stadio di morula, si differenziano in una blastocisti, formata da una quarantina di cellule, che si libera della zona pellucida ma non si impianta in utero; entra in diapausa ed in tale stato rimane sinché la madre non ha terminato l’allattamento (circa tre settimane dopo il parto). A questo punto gli embrioni si risvegliano e riprendono il loro normale sviluppo che prevede, in prima istanza, il loro impianto nella mucosa uterina. Fin dagli anni quaranta del secolo scorso era noto che la DE nei roditori poteva essere interrotta dalla somministrazione esogena di estradiolo. D’altra parte, un picco di estradiolo è proprio lo stimolo che induce l’impianto in utero dell’embrione di topo al quarto giorno dopo l’accoppiamento; inoltre, nel topo è possibile indurre una diapausa sperimentale: se femmine di topo vengono ovariectomizzate poco dopo la fecondazione e viene loro somministrato progesterone, gli embrioni entrano in diapausa allo stadio di blastocisti ed in tale stato rimangono anche per lunghi periodi sinché lo sperimentatore non somministra una adeguata dose di estradiolo. Dopo poche ore gli embrioni si impianteranno in utero (Cha et al., 2013). Gli estrogeni che determinano l’inizio dell’impianto agiscono tramite recettori che si trovano sull’epitelio e nello stroma della parete uterina, ma non sull’embrione rivelando che il risveglio dell’embrione è legato a fattori prodotti dall’utero sotto l’effetto degli estrogeni.

La diapausa obbligata è la più diffusa tra i mammiferi. Tra i carnivori buoni modelli sperimentali sono la moffetta (Spilogale gracilis) ed il visone (Neovison vison). La moffetta si accoppia in autunno, mentre l’impianto dell’embrione in utero ed il parto sono posticipati alla primavera successiva con una diapausa che dura circa 200 giorni. Il visone, invece, si accoppia in marzo e la diapausa dura solo alcune settimane in modo da consentire che il parto avvenga in primavera avanzata (la gravidanza in questa specie dura un mese circa). Il controllo della DE in questi animali è strettamente legato al fotoperiodismo. L’incremento del periodo di luce è lo stimolo che sblocca l’embriogenesi: l’epifisi riduce drasticamente la secrezione di melatonina e ciò provoca un conseguente aumento della secrezione di prolattina e di LH da parte dell’ipofisi (Murphy et al., 1990). Questi due ormoni ipofisari determinano un aumento della secrezione di progesterone da parte del corpo luteo che, a sua volta, attiva la mucosa uterina che diviene ricettiva per l’impianto dell’embrione (Douglas et al., 1998). Che la prolattina sia il fattore primario per il risveglio dalla diapausa in queste specie è dimostrato dal fatto che la somministrazione sperimentale di prolattina interrompe la diapausa e provoca un precoce impianto della blastocisti. Viceversa, la somministrazione di estradiolo non è in grado di indurre l’impianto in questi animali che sono strettamente legati per iniziare l’impianto alla attività della prolattina.

Nei marsupiali la DE è la strategia riproduttiva normale e può essere sia obbligata che facoltativa. Il wallaby (Macropus eugenii) è un canguro di piccole dimensioni su cui sono state svolte le principali ricerche sulla diapausa nei marsupiali. La diapausa facoltativa si verifica quando la femmina si accoppia subito dopo il parto ed è provocata dallo stimolo del succhiamento effettuato dal piccolo dentro il marsupio. Poiché lo sviluppo postnatale è parecchio lungo, la diapausa in questi animali può durare fino ad undici mesi. La diapausa obbligata è, invece, sotto il controllo del fotoperiodismo. Entrambi i tipi di diapausa sono controllati da fattori endocrini, in particolare dalla inibizione dell’attività del corpo luteo immaturo da parte della prolattina secreta dall’ipofisi stimolata dall’ipotalamo che, a sua volta, è attivato o dai segnali neurali provocati dal succhiamento oppure dal fotoperiodismo. In questi casi la secrezione di prolattina, inibendo la maturazione del corpo luteo, impedisce la secrezione di progesterone e mantiene un ambiente uterino inadatto per l’impianto della blastocisti (Renfree e Shaw, 2000).

Dunque nei tre modelli studiati i fattori endocrini che controllano la diapausa sono ben conosciuti, ma sono completamente differenti: nei roditori è un picco di estradiolo a sbloccare la DE, nei mustelidi il fattore attivante è la prolattina che, invece, nei marsupiali agisce come inibitore dello sviluppo. Poco è noto sui fattori che controllano la DE nel capriolo. Si tratta di una diapausa obbligata. L’accoppiamento in questa specie avviene in estate ma fino a dicembre avanzato o a gennaio la blastocisti non si impianta in utero. Dopo l’impianto segue una gravidanza di cinque mesi che permetterà di partorire nel periodo più favorevole: primavera inoltrata. Certamente è il fotoperiodo a giocare il ruolo principale in questa specie, ma vi è molta incertezza sui fattori che determinano il risveglio della blastocisti ed il suo impianto nella mucosa uterina (Beyes et al., 2017).

Aspetti evolutivi della diapausa.

Nel complesso la DE sembrerebbe confinata a solo un centinaio di specie di mammiferi, ma considerando questo fenomeno da un punto di vista evolutivo si sarebbe portati a pensare che potrebbe essere o essere stato molto più diffuso. Infatti, poiché la DE è associata a condizioni ambientali sfavorevoli al buon esito del processo riproduttivo, si può immaginare che questo fenomeno sarebbe stato molto vantaggioso per numerose specie, per esempio durante le glaciazioni, e che si sia confinato solo in poche specie in periodi recenti a causa di un miglioramento sostanziale delle condizioni climatico/ambientali. Esistono due differenti linee di pensiero sull’evoluzione della diapausa nei mammiferi (Fenelon et al., 2014). Secondo la prima la DE si sarebbe evoluta in più specie in maniera indipendente. Questo punto di vista è sostenuto da diverse osservazioni: 1) la DE è presente o assente in specie congeneri come Mustela erminea e Mustela frenata (con diapausa obbligata) o Mustela nivalis (senza diapausa); Spilogale gracilis (diapausa obbligata) e Spilogale putorius (senza diapausa); 2) la DE si riscontra in un’ampia varietà di specie che vanno dall’armadillo ad alcuni pipistrelli, canguri, mustelidi, foche e persino al capriolo che sono caratterizzate da una placentazione molto differente, così come differenti sono le loro strategie riproduttive; 3) le differenze nei meccanismi endocrini che regolano la diapausa: la prolattina mantiene la DE nei marsupiali, mentre la interrompe nei mustelidi e non ha alcun effetto nei roditori. Esistono, però, buone motivazioni per sostenere l’ipotesi opposta, cioè che la DE si sia evoluta una sola volta con lo scopo di difendere l’embrione o il neonato da condizioni avverse endogene o esogene e si sia poi mantenuta solo in alcune specie e persa (o non più utilizzata) in altre. La stessa diapausa facoltativa è un buon argomento a favore di questo modo di vedere, dal momento che questo tipo di diapausa si può instaurare o meno a seconda delle condizioni di stress materno. Inoltre è stato dimostrato sperimentalmente che embrioni di specie non soggette a diapausa possono andare in diapausa se trasferiti in utero di altra specie con diapausa in atto (Chang, 1968; Ptak et al., 2012). Ciò dimostrerebbe che gli embrioni di specie che non utilizzano la diapausa possono andare in diapausa senza subire danni e rispondono sia ai segnali chimici che inducono la diapausa sia a quelli finalizzati alla ripresa delle attività fisiologiche che porteranno all’inizio dell’impianto in utero e che sembrano essere comuni a tutte le specie di mammiferi placentati.

Nei ruminanti la DE sembra attualmente limitata al solo capriolo e nessun primate è stato associato a questa strategia riproduttiva. Tuttavia, se fosse vera l’ipotesi di un’ampia diffusione della DE nei mammiferi in periodi ancestrali, non è escluso che la capacità di andare incontro alla diapausa sia ancora presente anche negli embrioni di specie attuali che hanno rinunciato a questa strategia. Fin dal 1978 Foresman e Mead erano stati in grado di dimostrare che nel furetto (Mustela putorius), un mustelide che non utilizza la DE, è possibile indurre tramite ovariectomia e somministrazione esogena di progesterone dopo la fecondazione un ritardo d’impianto di almeno sei giorni, rimanendo le blastocisti ancora vitali ed in grado di impiantarsi in utero.

Più recentemente Ptak et al. (2012) hanno dimostrato che anche le blastocisti di pecora (specie senza diapausa) possono andare in diapausa in condizioni sperimentali adeguate. Questi ricercatori hanno trasferito blastocisti di pecora nell’utero di femmine di topo pseudogravide, ovariectomizzate e trattate con opportune dosi di progesterone in modo da riprodurre la condizione ormonale tipica della diapausa nel topo. Anche le blastocisti di pecora sono andate in diapausa e, dopo sette giorni, sono state recuperate e trasferite nell’utero di pecore ricettive ove si sono impiantate e sviluppate regolarmente. Dunque anche embrioni di specie non caratterizzate dalla DE possono andare in diapausa per periodi più o meno lunghi per poi risvegliarsi e proseguire il loro normale sviluppo.

Fattori uterini nel controllo della diapausa e dell’impianto dell’embrione.

Ma quanto è estesa tra i mammiferi questa capacità? E’ possibile che sia presente anche nei primati e nell’uomo? Non ci sono dati sperimentali che permettano di rispondere a quest’ultima domanda. E’, tuttavia, interessante notare che, sebbene il controllo ormonale della DE sia notevolmente diverso in specie diverse, non c’è dubbio che i fattori prodotti dall’utero per il controllo dell’impianto della blastocisti siano, invece, molto simili tra specie diverse e coinvolgano numerose citochine quali l’interleuchina-1β e il LIF (Leukemia Inhibitory Factor), come pure fattori di crescita quali BMP2 (Bone Morphogenic Protein-2) e FGF (Fibroblast Growth Factor). Un particolare gruppo di fattori implicati nell’inizio dell’impianto della blastocisti in utero è costituito dagli endocannabinoidi, molecole la cui esistenza e le cui funzioni sono una scoperta relativamente recente. Lo studio degli effetti del ∆9-tetraidrocannabinolo (TIB), il principale principio attivo della marijuana, aveva evidenziato che questa sostanza agisce legandosi a due recettori: CB1, espresso soprattutto nel sistema nervoso, e CB2 espresso in molti tessuti periferici. La presenza di questi recettori ha indotto i ricercatori ad ipotizzare l’esistenza di cannabinoidi endogeni capaci di legarsi a questi recettori. L’ipotesi si è rivelata corretta. Esistono veramente gli endocannabinoidi, molecole segnale prodotte a partire dall’acido arachidonico e capaci di legarsi ai recettori CB1 e CB2. Si ritiene che il sistema endocannabinoide possa essere coinvolto in molti processi fisiologici quali la memoria e l’apprendimento, la modulazione del dolore e del sistema immunitario (Di Marzo, 1998). Molto interessante è stata la scoperta della presenza dei recettori CB1 e CB2 a livello sia della blastocisti che della mucosa dell’utero. L’endocannabinoide più conosciuto e studiato è l’anandamide (arachidonoiletanolammide, AED). Ebbene, è stato scoperto che proprio i livelli di AED giocano un ruolo essenziale nella riattivazione embrionale post diapausa (Wang et al., 2003). Alti livelli di AED nel topo mantengono la diapausa, mentre l’abbassamento dei livelli riattiva la blastocisti e permette l’inizio dell’impianto; inoltre, l’espressione di CB1 della blastocisti è elevata durante la diapausa e molto bassa al momento della riattivazione. E ancora, i livelli di AED sono molto bassi nelle zone dell’utero dove si impianterà la blastocisti e molto alti nelle zone dell’utero dove l’impianto non avviene.

Diapausa embrionale anche nell’uomo?

Se davvero la DE è stata un meccanismo di difesa comune a tutti i mammiferi e che in tutti i mammiferi ancora rimane il ricordo di tale meccanismo, siamo autorizzati a pensare che anche nella specie umana la DE sia un evento possibile. E’ ovvio che esperimenti sull’uomo per indagare questo fenomeno non sono fattibili per ragioni etiche, anche se tecnicamente possibili. Esistono, tuttavia, alcuni dati che possono indurre a pensare che la DE si manifesti ancora anche nella specie umana.

Grinsted e Avery (1996) riportano un case report spiegabile solo con un fenomeno di DE: una donna di 36 anni dopo quattro gravidanze decide di farsi sterilizzare, ma dopo qualche anno, scontenta di quella decisione, vuole di nuovo avere un figlio e si sottopone ad embryo transfer. Le vengono trasferiti in utero tre embrioni derivati da fecondazione in vitro. La gravidanza, però, si instaura solo dopo 5 settimane dal trapianto, come evidenziato dai livelli di hCG e, di conseguenza, il parto avviene con 5 settimane di ritardo rispetto all’atteso. Da notare che i parti della terza e quarta gravidanza normale si erano verificati con un ritardo di 5 e 2 settimane sulla base della data dell’ultima mestruazione. Il ritardo nell’instaurarsi della gravidanza è un fenomeno abbastanza diffuso nella pratica dell’embryo transfer, così come ritardi di alcune settimane nel parto si verificano frequentemente nella specie umana e se alcuni di questi possono essere imputabili ad errori di valutazione o di calcolo dei tempi rispetto all’ultima mestruazione, in molti casi si tratta di ritardi veri e propri, la cui causa non è nota. Per alcuni autori potrebbero essere dovuti a DE di qualche settimana magari legate a situazioni di stress materno.

E’ noto che la tecnica della fecondazione in vitro seguita da embryo transfer è caratterizzata da un’alta percentuale di insuccessi dovuti a mancato impianto o ad aborti molti precoci. Maccarone et al. (2002) sono stati in grado di correlare l’efficienza dell’embryo transfer con i livelli ematici di AEA, evidenziando come le pazienti che non erano in grado di instaurare una gravidanza avessero livelli ematici di AEA significativamente più elevati rispetto a quelle in cui si instaurava una gravidanza senza problemi. Poiché il sistema degli endocannabinoidi partecipa attivamente nella modulazione delle condizioni di ansia e di stress, in cui possono trovarsi le donne che si sottopongono alla pratica dell’embryo transfer, è ipotizzabile che in molte pazienti i livelli di AEA siano elevati proprio per questa ragione.

Nel complesso, dunque, esistono indizi rilevanti per pensare che anche nella specie umana si possano instaurare periodi di DE, forse imputabili ad incremento delle concentrazioni di AEA che, sfortunatamente, nella nostra specie si possono concludere con la mancata gravidanza o con aborti molto precoci. Naturalmente, in questo contesto, è ragionevole considerare i possibili effetti del fumo di marijuana sulle prime fasi della gestazione. Su questo aspetto non esistono dati epidemiologici, tuttavia se è vero che l’incremento della concentrazione di cannabinoidi in grado di legarsi ai recettori CB1 e CB2 gioca un ruolo essenziale nel controllo dell’impianto della blastocisti, l’incremento dei livelli ematici di TIB, dovuto all’uso di cannabis, potrebbe rappresentare un fattore di rischio molto elevato per l’esito della gravidanza, dal ritardo di impianto a alterazioni della decidualizzazione fino all’aborto precoce (Correa et al., 2016).

Leggi l’articolo completo: Erminio Giavini, Diapausa embrionale e possibili ripercussioni sulla riproduzione umana, in Scienze e Ricerche n. 54, dicembre 2017, pp. 31-34