Dalla terapia genica al doping genetico

di Rosa Ada Volpe & Filomena Mazzeo.

La terapia genica ha lo scopo di utilizzare i fondamenti dell’ingegneria genetica per uso terapeutico attraverso la correzione o la manipolazione di geni difettosi, ed è fondamentale per la cura di molte patologie degenerative. Il doping genetico sfrutta lo stesso concetto della terapia genica ma non a scopo terapeutico, bensì per migliorare le prestazioni degli atleti modificando alcuni geni che portano ad aumentare la resistenza e la massa muscolare. Dopo aver fatto cenno alle differenti tecniche di inserimento, tramite vettori, di geni ricombinanti, verranno descritti i principali transgeni responsabili del miglioramento delle prestazioni atletiche: in particolare quelli che aumentano l’emoglobina, l’ematocrito e il flusso emodinamico, e quelli che aumentano selettivamente la crescita della massa muscolare. Tale metodica sicuramente non è scevra di effetti avversi, e talora fatali, che ognuna di queste tecniche comporta sull’atleta. L’utilizzo del passaporto biologico-molecolare dell’atleta rappresenta una possibile strategia preventiva e cautelativa antidoping. 

 

Introduzione: concetto di terapia genica e doping genetico

Un gene è un’unità biologica di ereditarietà a codici semplificati, finalizzata alla realizzazione di una proteina. In alcuni casi il gene può contenere informazioni errate, che determinano una mancanza di sintesi o la produzione di una proteina  difettosa. La terapia genica, pertanto, ha lo scopo di correggere il difetto genetico introducendo geni funzionanti o manipolando geni esistenti per ottenere benefici terapeutici [1] [2]

Gli studi di terapia genica hanno consentito il trattamento di patologie degenerative che agiscono a livello neuromuscolare o, più in generale, che interessano l’apparato locomotore come la distrofia muscolare di Duchenne [3] [4].

Se questa terapia consente di aumentare le proteine dell’organismo, comprese quelle dei muscoli, di conseguenza è stata perciò anche ipotizzata la sua possibilità di essere utilizzata e sfruttata nello sport a scopo dopante. Questo tipo di tecnologia prende il nome di doping genetico che sfrutta dunque lo stesso concetto della terapia genica, ma non a scopo terapeutico, bensì per migliorare le prestazioni degli atleti portando all’interno delle cellule, con “vettori virali”, geni che sviluppano capacità, resistenza, forza del cuore, dei polmoni, dei muscoli. Sono circa 250 i geni che si stanno investigando, collegati in qualche modo al miglioramento delle performance sportive in particolare attraverso l’aumento della resistenza e della massa muscolare [5].

Sia che si tratti di sport, lavoro o della vita quotidiana, ogni abuso di farmaci è una forma di doping ed è perciò sempre scorretto, ma poiché l’abuso di sostanze o metodi per potenziare le prestazioni risale a tempi molto antichi, ben presto la comunità medica e sportiva è stata costretta a dare una risposta al problema [6].

Il doping infatti coinvolge atleti e tutto ciò che ruota intorno ad essi: amici, parenti, medici, farmacisti, biologi, chimici, case farmaceutiche e talvolta organizzazioni criminali [6] [7].

Lo studio sul doping genetico, dunque, è cominciato nel 2001, quando la commissione medica del Comitato Olimpico Internazionale si riunì per discutere le possibili implicazioni della terapia genica ossia l’impiego di terapie geniche in via di sviluppo per il trattamento di patologie degenerative, a scopo dopante. Tale lavoro è stato proseguito dalla WADA (World Anti Doping Agency), che ha promosso diverse iniziative in questo senso, tra cui la predisposizione di una lista di sostanze proibite, il finanziamento di specifici progetti di ricerca per rilevare nell’individuo la presenza di famaci dopanti e che ha dato la seguente definizione del doping genetico: “uso non terapeutico di cellule, geni ed elementi genetici o della modulazione dell’espressione genetica, con capacità di aumentare le prestazioni atletiche” (AMA-WADA, 2008).

Per meglio comprendere come si possano sfruttare le terapie geniche per il doping occorre approfondire il concetto stesso di terapia genica.

 

Strategie di terapia genica e somministrazione di geni terapeutici

 

Nell’approccio alla terapia genica occorre anzitutto comprendere i meccanismi patologici e fisiologici della malattia da curare, individuare il giusto bersaglio cellulare e l’appropriato metodo di trasferimento, ed infine, quando è possibile, creare un modello animale della patologia da curare per effettuare studi preclinici in vivo [2].

Tra le varie strategie di possibile utilizzo possiamo annoverare [2,3,5,7].

· la compensazione genica, ossia l’introduzione di copie funzionali del gene difettivo o assente;

· il riparo genico o  correzione del gene difettivo;

· l’inattivazione cioè introduzione di DNA e RNA antisenso per inibire l’espressione genica;

· la terapia anti-angiogenica  di  interruzione del nutrimento ai tumori;

· la terapia anticorpale ossia l’ introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari;

· la terapia anti-infiammatoria o prevenzione del riconoscimento dei tessuti da parte dell’organismo;

· la vaccinazione o introduzione di geni che inattivano agenti infettivi;

· le terapie cellulari: trapianto di cellule geneticamente modificate.

 

La terapia genica può essere utilizzata sia su cellule somatiche, modificando in tal modo il genoma di specifici tessuti come i muscoli, sia su cellule della riproduzione o germinali. Con il trasferimento genico su linee cellulari somatiche, si modifica il genoma di tessuti (muscoli, polmoni, cervello, ossa, reni, cuore etc.), senza che questa modificazione venga trasmessa alla generazione successiva; l’alterazione genetica riguarda esclusivamente il paziente su cui è stata realizzata. Ciò non significa che tale terapia sia priva di rischi. Ora si sta studiando quali possano essere le complicazioni derivanti dell’inserzione casuale di un gene estraneo nel genoma; secondo il vettore che si utilizza, i rischi possono essere più o meno elevati, determinando così le indicazioni e le contro-indicazioni di un dato trattamento [7].

L’applicazione di queste tecniche al doping genetico è proibita ed in particolare sono proibiti i seguenti metodi che hanno la potenziale capacità di migliorare la performance atletica attraverso:

· il trasferimento di polimeri di acidi nucleici o di analoghi di acido nucleico

· l’utilizzo di cellule geneticamente modificate

 

Se si trasferisce un gene ad una linea cellulare germinale, la modifica che si apporta al genoma verrà trasmessa alle generazioni successive attraverso le stesse cellule germinali (spermatozoi e ovuli). Attualmente è impossibile controllare completamente le alterazioni genetiche che vengono apportate da un trasferimento genico, di conseguenza si rischia di provocare delle anomalie fisiologiche che verrebbero trasmesse alle generazioni successive; inoltre, l’alterazione di materiale genetico ereditabile pone una serie di interrogativi dal punto di vista etico e morale. Per queste ragioni, la modificazione genetica di linee cellulari germinali non viene considerata una strategia adottabile, e la sua sperimentazione clinica è vietata legalmente in quasi tutti i paesi del mondo [2].

 

Meccanismo di azione della terapia genica

 

Il meccanismo di azione della terapia genica si esplica attraverso tecniche di trasferimento di geni modificati nel genoma umano con l’utilizzo di speciali vettori [8].

 

Metodi di trasferimento

I metodi di trasferimento del materiale genetico possono essere (Figura 1):

Ex vivo o in vitro

Le cellule bersaglio sono prelevate dal paziente, coltivate e modificate geneticamente in laboratorio e quindi reintrodotte nello stesso individuo. Questa tecnica è molto efficiente, non crea problemi di tipo immunologico ma può essere utilizzata solo per alcune malattie immunologiche, ematologiche e metaboliche.

Un possibile utilizzo ipotizzabile nella tecnica ex vivo del doping genetico consiste nel modificare l’emopoiesi agendo direttamente sul tessuto emopoietico.

In vivo locale o in situ o in vivo topico

Il materiale genetico, prodotto con l’introduzione di vettori, rilascia un fattore terapeutico in una specifica parte del corpo attraverso una somministrazione intra-tissutale. Questa tecnica è efficace solo per la cura dei tumori localizzati, per le patologie del cervello, dell’apparato scheletrico e muscolare e del tessuto cutaneo.

Un possibile utilizzo del doping genetico nella tecnica in vivo locale, consiste nell’agire direttamente sul muscolo (in particolare sui fattori di crescita o sui modificatori di fibre o sui cardio modulatori) oppure sulle articolazioni (in particolare sugli inibitori dell’infiammazione, sui fattori di riparo o sui recettori del dolore).

In vivo sistemico

La proteina prodotta dal transgene ottenuta con l’introduzione di vettori contenenti materiale genetico viene somministrato direttamente per via sistemica endovena o intra arteriosa o per inalazione nel corpo del paziente. Questa tecnica si utilizza per arrivare a cellule e tessuti poco accessibili ma è meno efficiente per l’attraversamento di svariate barriere organiche.

Un possibile utilizzo ipotizzabile nella tecnica sistemica del doping genetico, consiste nell’ impiegare a livello vascolare, fattori ormonali, anabolizzanti e killer del dolore.

 

Mezzi di trasferimento 

Per trasferire i geni modificati nel genoma umano si utilizzano diversi trasportatori, i cosiddetti “vettori”.

Il materiale genetico può essere trasportato da appositi vettori che possono essere virus o vettori non mediati da virus:

Vettori Virali   

Il materiale genetico può essere trasferito a cellule in coltura o in vivo agli esseri viventi usando i virus che, durante l’evoluzione, hanno sviluppato sistemi molto efficienti per introdurre il loro genoma (patrimonio genetico) in cellule per completare il loro ciclo vitale e generare altri virus. I virus utilizzati a questo scopo vengono modificati in modo da avere difetti di replicazione che gli consentano di introdurre contemporaneamente il gene di scelta ed elementi di regolazione che ne controllino l’espressione e ne assicurino l’inserimento nel tessuto corretto. L’utilizzo dei vettori virali risulta altamente efficiente nel trasferimento genico, ma può anche portare a reazioni immunitarie, tossicità ed eventuale mutagenesi. [9].

I virus più comunemente impiegati sono adenovirus, retrovirus e lentivirus.

Gli adenovirus, virus a DNA, sono i vettori migliori da usare quando le cellule che si vogliono raggiungere sono quelle del tessuto muscolare scheletrico, in particolare quelli di generazione avanzata che evitano rischi pro-infiammatori  [9]. 

I retrovirus, virus ad RNA, hanno la particolare proprietà di inserire il loro genoma portando una modificazione permanente nel genoma dell’ospite, a differenza di altri virus che non integrano il loro genoma nel nucleo delle cellule ospiti e il gene scelto si perde nelle successive divisioni [10].

I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia e il ciclo replicativo ma a differenza dei precedenti, possono infettare anche cellule non proliferanti come le cellule differenziate. Un possibile limite è dato dalla risposta immunitaria dell’ospite che può bloccare gli effetti di una ripetuta “somministrazione” di virus contente il materiale genetico da trasferire [11].

Vettori non virali 

I sistemi non virali di inserzione di materiale genico prevedono l’iniezione diretta del DNA nel nucleo della cellula ospite oppure di liposomi che trasportano il DNA; i liposomi hanno bassa immunogenicità ma sono poco efficienti nel rilascio genico in vivo ed hanno difficoltà a rilasciare il DNA nel nucleo.  Tutti i vettori non virali sono relativamente facili da preparare, meno costosi, presentano una tossicità inferiore, ma minore efficienza rispetto a quelli virali, in quanto sono instabili nella maggior parte dei tessuti e possono essere utilizzati in vivo solo per tessuti superficiali [12].

 

Queste sono in sintesi le caratteristiche che deve avere un vettore ideale:

· di facile produzione e in elevate quantità

· sicuro, cioè inerte dal punto di vista immunologico

· selettivo per determinati tipi cellulari

· capace di trasportare geni piccoli e grandi

· capace di infettare sia cellule in divisione che quiescenti

Dalla terapia genica al doping genetico

Il doping genetico sfrutta la terapia genica per migliorare le performance degli atleti e per farlo può modificare selettivamente una cellula o un gene, oppure rimodulare un recettore alla regolazione specifica dell’espressione di un gene dopo il trasferimento genico, oppure utilizzare specifici ormoni o anticorpi per stimolare o inibire l’espressione di un gene [1,7].

Potremmo schematicamente individuare tre livelli di doping genetico (Figura 2) poiché la manipolazione genetica può avvenire:

· prima della competizione: in tal caso l’effetto è di tipo anabolizzante

· durante la competizione: si somministrano sostanze che migliorano la performance

· dopo la competizione attraverso l’uso di sostanze di riparo

Gli studi effettuati negli ultimi vent’anni evidenziano le varie tipologie di geni le cui modifiche hanno indotto un aumento della resistenza alla fatica oppure un aumento della massa muscolare [8].

Ecco alcuni esempi di geni modificati attraverso il doping genetico per l’aumento della resistenza e della massa muscolare.

I geni coinvolti nell’aumento della resistenza allo sforzo fisico o al dolore sono i seguenti:

1) L’ EPO (Eritropoietina), è un regolatore fisiologico della produzione di globuli rossi che dunque  stimola l’eritropoiesi. Viene prodotta soprattutto nel rene in risposta all’ipossia e al cloruro di cobalto. In alta montagna a partire dai 3000 metri di altitudine si instaura la cosiddetta “acclimatazione ventilatoria”, caratterizzata da evidente aumento della ventilazione polmonare a riposo. L’esercizio fisico, sia in ipossia acuta che cronica, determina iperventilazione molto più elevata. L’iperventilazione oltre ad avere l’effetto di aumentare la quantità di ossigeno disponibile per i tessuti, provoca un aumento dell’eliminazione di anidride carbonica con l’espirazione. Dopo circa 15 giorni di permanenza in quota si verifica un aumento progressivo della concentrazione dei globuli rossi nel sangue circolante (poliglobulia), tanto più marcato quanto più elevata è la quota, raggiungendo i massimi valori dopo circa 6 settimane. Tale fenomeno rappresenta un ulteriore tentativo da parte dell’organismo di compensare gli effetti negativi dell’ipossia. Infatti, la ridotta pressione parziale d’ossigeno nel sangue arterioso provoca un’aumentata secrezione dell’ormone eritropoietina che stimola il midollo osseo ad incrementare il numero di globuli rossi, così da permettere all’emoglobina in essi contenuta, di trasportare una maggiore quantità di O2 ai tessuti. Inoltre insieme ai globuli rossi aumentano anche la concentrazione di emoglobina [Hb] ed il valore dell’ematocrito (Hct), cioè del volume percentuale di cellule del sangue in rapporto alla sua parte liquida (plasma). Sotto lo stimolo dell’ipossia acuta la frequenza cardiaca aumenta, per compensare con un maggior numero di battiti al minuto, la minore disponibilità di ossigeno, mentre cala la gittata sistolica (diminuisce cioè la quantità di sangue che il cuore pompa ad ogni battito). Nell’ipossia cronica la frequenza cardiaca ritorna ai valori normali. Nel complesso, gli studi indicano quindi che, dopo l’acclimatazione, si verifica un significativo aumento dell’emoglobina (Hb) e dell’ematocrito (Hct). Lo stimolo ipossico (naturale o artificiale) di durata adeguata produce, quindi, un reale incremento della massa eritrocitaria, seppure con una certa variabilità individuale. Ai fini del miglioramento della performance, tuttavia, è probabile che intervengano altri adattamenti periferici, come una maggiore capacità da parte del tessuto muscolare di estrarre ed utilizzare ossigeno. Questa affermazione è vera sia in soggetti sedentari che in atleti. I livelli di EPO in condizioni di ipossia stimolata geneticamente aumentano in maniera significativa e continuano a salire per circa tre ore anche dopo che è terminato lo stimolo ipossico per poi ridursi con una emivita di circa 5.2 h. [13] [14]

L’Eritropoietina ricombinante è abusata in alcuni sport di resistenza, come ad esempio il ciclismo [15] in quanto stimola la poliglobulia, ovvero un maggior numero di globuli rossi con conseguente aumento della capacità di trasportare ossigeno ai tessuti. Tale alterazione può senz’altro migliorare le prestazioni atletiche.  Studi preclinici hanno dimostrato che tale gene può essere introdotto con successo negli animali come scimmie e roditori [16] [17] ove la terapia genica con EPO incrementa il valore dell’ematocrito fino all’80% anche se sono stati descritti diversi effetti avversi tra i quali, paradossalmente, l’anemia [18].

2) La HIF (Hypoxia Inducible Factor) proteina che attiva i fattori indotti dall’ipossia modifica l’assunzione dell’ossigeno disponibile. L’HIF è una proteina contenuta nel nucleo cellulare che svolge un ruolo fondamentale nella trascrizione genica in risposta all’ipossia. E’ infatti un fattore di trascrizione che codifica per le proteine coinvolte nella risposta ipossica ed è fondamentale per la sintesi dell’eritropoietina. In condizioni di ipossia la via del sensore di ossigeno (per molte cellule è rappresentato dal citocromo C-Ossidasi) è bloccata, quindi l’HIF aumenta. Con l’utilizzo di questa proteina ricombinante sono stati riscontrati disturbi cardiocircolatori anche fatali. [19].

3) Il PPARdelta, (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor delta) recettore attivante la proliferazione dei perossisomi -, codifica gli enzimi di ossidazione degli acidi grassi. Tale fattore è coinvolto in alcune modificazioni del metabolismo energetico ed è associato alla formazione delle fibre muscolari di tipo I (fibre lente, che determinano la resistenza) e può indurre anche la conversione da fibre di tipo II (fibre veloci, che determinano la velocità) a fibre di tipo I. Gli atleti in genere hanno alti livelli di fibre di tipo I. L’inserimento del gene PPAR-delta migliora significativamente la resistenza degli animali e contrasta lo sviluppo di obesità migliorando il metabolismo anche in assenza di esercizio. Gli effetti fisiologici di PPAR-delta sono da attribuire alla aumentata capacità da parte del tessuto muscolare di ossidare gli acidi grassi per soddisfare le richieste energetiche dell’organismo [20-21]. Effetti avversi con l’utilizzo di questo recettore ricombinante sono soprattutto le abnormi risposte immunitarie dell’organismo [22].

(… segue …)

Leggi l’articolo completo: Rosa Ada Volpe & Filomena Mazzeo, Dalla terapia genica al doping genetico, in Scienze e Ricerche n. 36, 1° settembre 2016, pp. 81-88